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    細胞生物活性的化學檢測法

    發布時間: 2012-01-31  點擊次數: 3021次

    細胞生物活性的化學檢測法
    一、四唑鹽(MTT)比色法:
    檢測細胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外,還可用四唑鹽比色法試驗(MTT)。此法的原理是:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物,并沉積在細胞中,而細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結晶物,用酶聯免疫檢測,以在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反應活細胞數量。在一定細胞數范圍內,MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。
    ●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞,用含0.1%胎牛血清的RPMI培養基配成1 x10^9個/L的但細胞懸液,將細胞接種于96孔培養板中,每孔100ul。
    ●將培養板置CO2培養箱中,在37℃、5%CO2條件下,培養3-5天。
    ●培養3-5天后,每孔加入MTT溶液10ul,繼續置培養箱孵育3-6h,終止培養,加10%SDS-HCl 100ul/孔,37℃培養數小時,將細胞內與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。
    ●用酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度(OD),選波長490nm。以時間為橫軸,OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。
    用此法測細胞活力,為保證結果的準確性,在試驗前測定每種細胞的貼比率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,再確定每孔細胞接種數和培養時間,以保證培養終止時不會過滿。另外,實驗時設空白對照,比色時,以空白孔調零。
    二、細胞蛋白質含量測定法(考馬斯亮藍測定法):
    基本原理為:考馬斯亮藍在酸性溶液與蛋白質結合,在595nm波長處呈zui大吸收,其OD值與蛋白質含量成正比。主要用于測定妹、受體及細胞外代謝物的特異性活性。
    ●用0.25%胰蛋白酶消化細胞,制成懸液,用含10%胎牛血清的RPMI培養基調整細胞濃度為1×104個/ml,接種24孔培養板,每孔1ml,置37℃、5%CO2條件下培養一段時間。
    ●用胰蛋白酶消化分散,培養板的細胞懸浮在PBS中,細胞計數,取106細胞以1000r/min離心5min,棄上清,加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH,置100℃煮3min,使細胞裂解。
    ●取0.1考馬斯亮藍染液與100ul上述細胞裂解液混勻,放置10min。
    ●用可見光分光光度計在595nm波長處測定溶液的OD值。以溶劑為空白對照,以已知量的牛血清蛋白為標準品,繪制標準曲線。然后根據曲線推算樣品中蛋白質含量。
    三、細胞蛋白質合成測定法(3H-亮氨酸摻入法):
    基本原理為:細胞在合成蛋白質時需要攝取外源性氨基酸,用同位素標記氨基酸如3H-亮氨酸可以摻入細胞蛋白合成代謝中,通過測定細胞的放射性強度,可了解細胞蛋白質合成代謝情況。
    ●取對數生長期細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,懸浮于含10%胎牛血清的RPMI培養基中,調整細胞密度107-109個/L,接種于24孔培養板,每孔1ml。
    ●將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養至細胞處于對數生長期時,每孔100ul預溫37℃的3H-亮氨酸。
    ●繼續培養4-24h。
    ●終止培養,取出培養板,小心吸取培養上清,用預冷的PBS洗滌,晾干。如果細胞松散,可先用甲醇固定10min。
    ●把培養板放在冰蓋上,每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA),在4℃放置10min,吸取上清。
    ●甲醇洗滌、晾干。
    ●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH,1%SDS,室溫下放置30min。
    ●混勻,移入閃爍液,用液體閃爍計數儀測定每分鐘脈沖數(cpm),以cpm/106細胞或cpm/mg蛋白表示。
    對懸浮生長的細胞則采用離心法處理。
    四、細胞DNA合成測定法:
    1、3H-TdR摻入法
    基本原理為:胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA*的堿基,也是DNA合成的必需物質。用同位素3H標記即3H-TdR作為DNA合成的前體摻入DNA合成代謝過程中,通過測定細胞的放射性強度,可以反映細胞DNA的代謝及細胞增殖情況。
    (一)方法一
    ●取對數生長期細胞,制成3 X 10^8個/L的細胞懸液,接種于24孔培養板中,每孔1ml。
    ●將培養板放入37℃、5%CO2培養箱中培養24h左右。
    ●在細胞處于對數生長期時,每孔加入100ul3H-TdR(用HBSS)配制,3.7 X 10^8 Bp/L過濾除菌,使終濃度為3.7 X 10^7 Bp/L。
    ●繼續培養1-24h。
    ●終止培養,小心吸棄上清,用HBSS漂洗單層細胞2次,然后加入2mo預冷的10%TCA,放置10min。如果細胞松散,應先用固定甲醇10min,用液體閃爍計數儀測定每分鐘脈沖數,結果以cpm/10^6細胞表示。
    (二)方法二
    ●同方法一*步。
    ●將培養板放入37℃、5%CO2培養箱中培養56h左右。
    ●每孔加入100ul 3H-TdR。
    ●繼續培養16h。
    ●終止培養,將細胞收集于49型濾膜上,如為貼壁細胞,吸棄培養上清后,用0.25%胰蛋白酶消化2-5min;如為血細胞,先用蒸餾水破紅細胞。然后再收集細胞,收集后要加10%CTA和甲醇固定。
    ●將濾膜烘干后移入已知有3min閃爍液的閃爍瓶中,在液體閃爍計數儀上測定每分鐘脈沖數或衰變數,結果以cpm/10^6細胞或dpm/10^6細胞表示。
    2、流式細胞儀測定DNA合成
    用流式細胞儀測定細胞增殖周期和DNA合成是20世紀90年代發展起來的新手段,不僅快速、準確、效果好,而且消除了同位素標記的許多繁瑣方法和放射性污染。
    ●取80%匯合至接近*匯合的細胞,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,制備成單細胞懸液,細胞密度1想0^9個/L,注意不要留有細胞碎片。
    進行流式細胞儀檢測。除檢測細胞周期時相變化和反應DNA合成外,還可了解染色體倍性;結合熒光免疫法,還可對細胞膜進行分析等。

    細胞生物活性的化學檢測法

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